WWOX 抗体

Anti-WWOX 抗体|现货 ，用于WB、FITC、IHC-P、IHC-F、IF、Elisa说明书多种荧光标记现货供应

【产品编号】：RSm-3470M                       
【产品用途】：科研实验，“Anti-WWOX 抗体|现货”用于免疫组化实验，WB实验，相应的标记抗体有HRP标记抗体，FITC标记，BIO等。
【性 状】： Lyophilized or Liquid
【浓 度】： 1mg/1ml
【亚 型】： IgG
【贮 存】： 贮存于-20℃.
产品应用比例:  WB=1:100-500 Elisa=1:500-1000 IP=1:20-100 IHC-P=1:100-500 IHC-F=1:100-500 Flow-Cyt=1/20-1/100  。
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兔抗或鼠抗      Anti-|现货         ，多种荧光标记用于用于WB、FITC、IHC-P、IHC-F、IF、Elisa说明书 相关知识》》
免疫印迹（WB）荧光检测常见问题：
免疫印迹（WB）荧光检测取决于抗原含量、一抗敏感度、二抗敏感度、底物敏感度、显影和定影效率。
比较可靠的作法是：如可观察荧光，则压片10-30s；如观察不到，则同时压两张X光片。10-30min洗一张，如果没有结果，则再补一张，1h后洗，再没有结果，则压片过夜。共3张片，根据每次结果调整。
其中两张X光片的压法：
先剪一张比膜长2-3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了*张胶片，就不会因为取放第二张胶片而使*张移动。然后放第二张胶片，与*张片子贴在一起。
注意：片子要干燥。压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体残留导致其与下面一张X光片粘在一起。取时，用手轻轻拂过，使上面的X光片与下面的X光片错开了，然后轻轻拿起。
现象  原因   解决
 反影（白色条带，黑色背景）  1 HRP过高（背景较高）  至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注1
 显影后膜上条带处变为黄色  2 HRP过高（敏感性太高）  至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注2
 信号弱或无  3 HRP过高引起底物迅速耗竭  至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注3
   4 抗体-抗原系统敏感性过低  提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
   5 转膜不充分/过转  优化转膜条件*注5
   6 HRP或底物活性降低  测试活性或选用敏感底物 *注6
 高背景  7 HRP过高（背景较高）  至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注7
   8 封闭时间不足  延长封闭时间4度过夜*注8
   9 抗体与封闭液有交叉  更换封闭液（如3%BSA的TBST）*注9
  10 TBST洗脱不足 增加洗脱时间、次数、用量*注10
   11 暴光时间过长  降低暴光时间*注11
   12 抗原-抗体浓度过高  降低抗体浓度或蛋白上样量*注12
 条带内无显影的白点 13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间）  精细操作*注13
   14 膜平衡不均/油脂污染 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14
   15 膜与X光片间有气泡  显影前去除气泡*注15
 非特异性条带 16 抗体交叉反应  至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注16
  17 SDS非特异性结合蛋白条带 使用无SDS转膜液*注17
 散在小圆斑 18 封闭液有杂质颗粒  静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18
 *注1 其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带。形成机制：条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则是原因3的现象。在暗室观察是否条带周围有荧光而条带处为暗。如是，则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片。否则一旦耗竭底物，通过减少压片时间，不能解决问题。也可以过一段时间HRP稍减后，重新加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，其原因和上所述相同，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄。压出的X光片可能是正常的，或和原因1或原因3的现象同时存在，仅是一种表面现象，在压过的膜可以看出来。（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1-2min就可以看出来，所以要把握时机。）如果没有达到原因1和原因3的程度，那么一定能够看到很强的荧光，是一种良好的实验结果。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象，可以不予处理。如果因为荧光太强极易导致条带增粗变大，那么也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s-30s，甚至3-5s，根据结果在暗室进行调整。但也可能由于HRP浓度，无论怎么减少压片时间，条带都依然粗大；那么如果想获得漂亮条带，则必须通过降低抗体浓度来解决。原因1和3，如出现这样的情况，解决方法也是一样的。
*注3 这是与1类似，但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，需要特别注意。在HRP*的情况下，来不及压片就底物已耗竭，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦底物耗竭，通过减少压片时间不能解决问题。也可待HRP稍减后，用TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下，一抗、二抗稀释10倍以上，依然荧光明显。
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单，在此不赘述。随抗体浓度增高，背景和非特异性可能会增加。一般而言，上样量的极限：对于裂解的混合蛋白，上样孔底面积（平方毫米）* 30ug = 极限上样量；而对于同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白，则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量（见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章）。超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱，可通过加大上样量、提高抗体浓度、使用敏感底物、延长压片时间解决。但因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都整齐的极限，而上样超量的表现是，随量的加大，变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限，比如对于150kd的蛋白，*可以超出一般极限上样量的2倍而不变形（此时，中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）。
*注5 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因。增加转膜力度：加大电压/电流、延长时间。但对于小分子蛋白（<30kd就需要注意，<15kd尤其要当心）很可能出现过转。经过观察丽春红染膜或marker有没有穿膜，可以确认。如没有丽春红，可以用考马斯亮蓝法染色转膜后的PAGE胶。如果是PAGE胶一片空白，则可适当降低转膜力度。对于低分子量，转膜液一般不加SDS以防过转。《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓冲液也是不含SDS的。
*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。
*注7 高背景原因是HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包括直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不*等。在稀释抗体降低背景的同时，会降低对目的蛋白的结合效率，即以牺牲信号强度为代价。不过，还有一种与稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感的情况。无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景，或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快，如果稀释抗体，则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下，需要提高抗体含量以提高条带显示程度，而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害。这样则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的。
*注8 这一点大都不受重视，所以有时候会有些意外。一般室温2-4h，但4℃过夜*的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握，且更容易获得较好的效果。
*注9 实际上，脱脂奶粉对于多数抗体而言都不影响实验，但所有二抗可能与牛奶有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。
*注10 一般10min * 3次即可，也可适当增加时间、次数和洗脱液用量。
*注11 以牺牲敏感度为代价，其zui低标准是使目的条带能够正常显影。
*注12 以牺牲敏感度为代价，其zui低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的问题有效。
*注13 主要是因为气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上。正确的作法是：把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，然后慢慢落下凝胶，直至胶膜重合。
*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色。
*注15 这样现象很少出现。
*注16 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但偶尔单抗出现这样的情况。Western Blotting的抗体选择：的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素。混合单抗，虽然针对多个表位，但代价太高，需购置多个单抗然后混合。纯化多抗，基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，是实际中的*。单抗，虽然特异性好，但如其针对的表位在提取蛋白时被破坏，则其敏感度会下降甚，故不稳定。普通多抗，虽然表位多，但因含其他抗体，特异性较差，会有很多杂带甚至背景。
*注17 这样的现象较少出现。
*注18 主要原因是脱脂奶粉悬液中会有一些不悬浮的大颗粒，其对封闭无益。脱脂奶粉配好后可在4度静置，这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时吸上面的液体。

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